【标记】抗体标记量、标记pH与标记方法详解

一、最适标记pH(最核心参数):原则:pH略高于抗体等电点(pI)。实测值:IgG多抗pH9.0;单抗pH8.2;亲和层析抗体pH7.6;SPA pH5.9~6.2;ConA pH8.0;亲和素pH9.0~10.0;链亲和素先调pH4~6.5反应后缓慢复碱至7.5。调节:0.1M K₂CO₃或0.1M HCl,用Whatman精密pH试纸(禁用pH计防电极堵塞)。二、最适蛋白量(NaCl破坏试验):10管各1mL金液+抗体梯度5~50μg/mL→各加0.1mL 10% NaCl→静置2h→仍红色管对应最低稳定量。实际标记量=最低量×1.1~1.2(加安全系数)。参考值:夹心法10~20μg/mL;竞争法1~5μg/mL;青霉素抗体4~6μg/mL;盐酸克伦特罗单抗20μg/mL。三、标记方法:常规法:调pH→加抗体→室温振荡30min→封闭→离心→复溶。不饱和标记法(提升灵敏度):pH低于最适1.5~2.0+抗体量70~80%+封闭剂稳定剂同时加入。缓慢复碱法:金液pH7.5→加抗体→HCl调至酸性(pH4~6.5)反应10~30min→4℃冷却15min→1%K₂CO₃缓慢滴加(每10秒1滴)至pH7.5~8.0。来源:生物谷+专利+丁香园