胶体金标记效率测定 — UV-Vis法/BCA法/活性回收率计算/离心上清法

胶体金标记效率测定四种方法: 一、UV-Vis分光光度法(最简便):分别测定金标抗体溶液OD₅₂₀(金特征峰)→离心后上清OD₅₂₀→OD₅₂₈(蛋白特征峰)。标记率(%)=(标记前OD₅₂₀−离心上清OD₅₂₀)/标记前OD₅₂₀×100%。蛋白结合量:标记前蛋白总量−离心上清蛋白量(BCA法定量)。理想标记率>85%。 二、BCA蛋白定量法(标记量确认):分别测标记前抗体总量→离心后上清游离抗体量→差值=结合到金上的抗体量。标记量(μg抗体/mg金)=结合抗体量/金质量。典型值:10~20μg抗体/mg金(夹心法)/1~5μg抗体/mg金(竞争法)。 三、活性回收率(最重要):标记后抗体活性通常下降到标记前的30~70%。计算:活性回收率(%)=(金标抗体的ELISA滴度/标记前等量抗体的ELISA滴度)×100%。>50%可接受/>70%优秀。偏低原因:标记pH偏离最适值/抗体量过多竞争/离心过程损伤/封闭剂覆盖活性位点。 四、离心上清OD₂₅₂/OD₅₂₀比值法:取离心后上清测OD₂₅₂和OD₅₂₀。OD₂₅₂/OD₅₂₀>1.5→上清残余多量游离蛋白→标记不充分→需增加金量或减少蛋白量。OD₂₅₂/OD₅₂₀<0.5→蛋白基本结合完全→标记充分。 五、标记效率快速判定:目视法(粗判):金标抗体溶液仍保持酒红透亮→标记成功。溶液发紫发蓝→金聚集→标记失败。低速离心后上清清澈无沉淀→标记完整。上清浑浊有灰色沉淀→部分金聚集。 六、金标记效率优化:保证最适pH(每批抗体实测pI再+0.5~1.0)。蛋白量取盐絮凝法最低稳定量×1.1~1.2。封闭时间30min(过短封闭不充分/过长蛋白活性下降)。离心速度选该粒径最低要求(过高剪切力损伤抗体)。 来源:生物谷+丁香园+CNKI