血清甘油三酯的酶法测定
ICs 11.020
C50
中华人民共和国卫生行业标准
Ws/T355ˉ—ˉ2011
血清甘油三酯的酶法测定
GuideIines for enzy口natiC measurements of seruⅡl triglycerides
2011-12-14.发布
中华人民共和国卫生部
发布
2012-o6-o1 实施
Ws/T 355-ˉ 2011
目刂
舀
本标准按照GB/T1.⒈
2009给出的规则起草。
本标准参考中华医学会检验学会《血脂测定推荐方法》、中华医学会检验分会血脂专家委员会《关于
临床血脂测定的建议》制定。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准起草单位:卫生部北京老年医学研究所。
本标准起草人:王抒、董军、陈文祥。
Ws/T355—2011
血清甘油三酯的酶法测定
1 范围
本标准规定了血清甘油三酯酶法测定及其质量保证的基本原则。
本标准适用于临床实验室和流行病学及营养调查中的血清甘油三酯测定。生产厂商制备甘油三酯
酶法测定试剂盒也可参照使用。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文仵。
2.1
分析系统 ana1yticaI system
对某检验项目在规定浓度范围内,给出分析结果的一组按规定条件使用的仪器和装置,包括试剂和
物品。
E改自ISo/IEC导则99:2007,3.2测量系统measuHng system]
注1:对于临床生物化学检验,分析系统主要由按规定条件使用的仪器、试剂和校准物组成。
注2:其他标准(如GB/T22576— 2008)中的类似概念为“检验程序”,但检验程序包括更广泛内容,对于本标准,分
析系统相当于检验程序的分析部分。
2.2
验证 verification
提供客观证据,考虑任何测量不确定度,说明给定事物满足规定要求。
[ISO/IEC导则99:2007,2.44]
注1:本标准主要是指分析系统的验证,即某分析系统在本实验室的性能是否与规定性能指标或厂商提供的性能
指标一致。
注2:有关概念是“确认”(validao°rl,,即“规定要求”满足指定用途的验证,本标准的验证包含确认的含义。
2.3
甘油三酯 trigIyceride
甘油三酯是指甘油的三脂肪酸酯,形成甘油三酯的脂肪酸有多种,因此甘油三酯是一组化合物,而
不是分子组成和结构固定的单一化合物。此外,血中还存在少量甘油二酯、甘油一酯和游离甘油(正常
情况下甘油二酯和甘油一酯之和不足甘油三酯的3%,游离甘油约0.11mmo1/L)。
甘油三酯重量多以
三油酸甘油酯(相对分子质量885.5)计。
3 方法概述
3.1 总甘油测定
目前,临床实验室普遍采用酶法测定血清甘油三酯。首先,用脂肪酶水解甘油三酯为甘油和脂肪
酸,然后,以多种方法测定其中的甘油部分。通常先用甘油激酶和三磷酸腺苷(ATP)将甘油磷酸化,生
成磷酸甘油或二磷酸腺苷(ADP),用氧化酶或脱氢酶检测磷酸甘油,也有用丙酮酸激酶检测ADP。
多
数情况下测定的结果是总甘油,即包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和游离甘油之和。
3.2
、Vs/T 355-ˉ 2011
去除游离甘油的方法
需要除去游离甘油时,常用以下两种方法
:
b)
外游离甘油空白法:分别用含脂肪酶和不含脂肪酶的试剂分析样品,以测定样品的总甘油和游
离甘油,自总甘油中减去游离甘油得甘油三酯
;
内游离甘油空白法,有两种基本模式
:
1) 将试剂中的脂肪酶与其他试剂成分分开,样品先与不含脂肪酶的试剂混合,温育后测定吸
光度,加入脂肪酶并温育后再测定吸光度,用两吸光度之差计算甘油三酯浓度,多见于使
用NAD/NADH氧还反应的方法
;
2) 仅限于使用Trinder反应的方法,第一步试剂除不含脂肪酶外,也不含⒋氨基安替比林
,
将样品与第一试剂混合并温育一定时间后,加人含脂肪酶和4-氨基安替比林的第二试剂
温育后测定,由于第一步反应系统中不含脂肪酶及⒋氨基安替比林,游离甘油产生的过氧
化氢在过氧化物酶的作用下与另一色原(酚类化合物)反应产生无色物质,因此在加人第
二试剂之前不需测定吸光度;第二步反应中的脂肪酶可有效消除乳糜样品的混浊,且
TⅡnder反应产物的最大吸收波长多在500nm以上,可只做试剂空白,样品混浊对测定
结果影响较小。内游离甘油空白法不增加样品和试剂用量,但试剂需分两步加人,也不能
获得样品的游离甘油含量。
4 分析系统
酶试剂
选用的血清甘油三酯酶法测定试剂盒中的酶试剂应能符合以下质量要求
:
—— 能水解99%以上的血清甘油三酯
;
——特异性高,干扰因素少
;
—— 在37℃与血清反应达终点所需时间小于5mh,终点时吸光度至少能稳定60min;
———在血清甘油三酯浓度Omm° l/L~11.29mmol/L(O mg/dL~1000mg/dL)范
围内,吸光度与
浓度呈通过原点的直线关系;
——试剂溶液在测定波长下的吸光度小于0.05;
—— 在规定温度下保持稳定1年
;
——试剂批间差小于1%。
校准物质和质控物
酶法测定甘油三酯使用的校准物和质控物应符合如下要求
:
——可使用血清校准物,在测定总甘油的方法中也可使用甘油水溶液校准物
;
ˉ— —使用校准物的甘油三酯浓度应在我国人血清甘油三酯水平高低划分界限(见附录A)附近,在
所选用的试剂、仪器条件下能使新鲜样品测定结果可溯源到甘油三酯参考系统(见附录B);
——使用时应将校准物的温度升至室温并充分混匀。冰冻融化后的血清校准物质可于2℃~8℃
贮存3d,不可反复冻融
;
——制备质控物应认真选择原料和工艺,使其具有与样品相同或相似的物理、化学性质,贮存于
—⒛℃以下;如果是冰冻或冻干血清制备的质控物质融化或复溶后应使其温度升至室温,充
分均匀;融化后的质控物质可于2℃~8℃贮存3d不可反复冻融。甘油三酯浓度在我国人血
清甘油三酯水平高低划分界限(见附录A)附近。
4.1
4,2
、Vs/T 355-ˉ 2011
4.3 仪器和设备
可选用自动生化分析仪,亦可选用光度计配合移液和恒温设备。所选用的仪器设备应满足以下
要求:
——光度分析系统在0.1~0.8(500nm)吸光度范围内的测定不精密度(Cη 小于1%;
——移液系统的移液不精密度(Cη 小于1%;
—— 叵温系统在25℃~37℃范围内温度变异小于1℃。
5 样品采集和处理
5.1 受试者准备
受试者应在取血前2周保持平时饮食习惯;近期内无急性病、外伤、手术等异常情况;取血前24h
不饮酒、不做剧烈运动;取血前禁食12h除卧床患者外,取血前至少静坐5min。
5.2 取血方法
取前臂静脉血,止血带的使用不超过1min,避免溶血。
5.3 血样品的处理、贮存和测定前准备
血液样品采取后室温下静置30min~45min使凝固,避免溶血,1500r/mh~3ooo r/min(离心力
1100g~1300g)离心10min后及时吸出血清,置试管中密闭。分离的血清可于2℃~8℃贮存1周。
—⒛℃以下可贮存更长时间,用时融化并使其温度升至室温,充分混匀。不可反复冻融。
注:亦可制备血浆用于甘油三酯测定,用乙二胺四乙酸二钠作抗凝剂,血液中抗凝剂浓度为1g/L时血浆甘油三酯
浓度比血清低约3%。
6 测定步骤
6.1 安全措施
血清样品和来源于血液的参考物质、质控物质、校准物质有可能含致病微生物,须避免吞人或与皮
肤接触;应按有潜在生物传染性样本对待,使用时遵循生物安全规则,并根据规定对废弃物进行处理。
6.2 测定程序及测定结果的表述
准备或开启仪器设备。按商品试剂盒说明书规定的样品-试剂比例、反应温度和时间及光度测定条
件,自动或手工进行校准物、质控物或样品-试剂混合、温育和吸光度测定。应注意以下事项
:
——尽量选择能提高测定特异性的空白试验方式和测定方式;
——校准物质的重复测定数至少为2;
——保留用过的酶试剂、校准物、质控物和样品至测定质量评价以后
;
——按式(1)计算样品和质控物质的甘油三酯浓度
:
c样品=E(A样
品~A空
白)/(A校
浪^A空
白)彐
×
c校浪
⋯
⋯
⋯
⋯
⋯
⋯
⋯
¨ (1)
式中:
c样品~~样品或质控物质的甘油三酯浓度,单位为毫摩尔每升(mmol/L);
c技准~~校准物质的甘油三酯浓度,单位为毫摩尔每升(mmol/L);
A佯品~~样品或质控物质的吸光度;
、Vs/T 355-2011
A校准~~~校准物质的吸光度
;
A空白^ 空白的吸光度。
——所得结果应表示至2位小数。
7 测定质童的监测和保持
7,1 方法的灵敏度和特异性
7.1.1 灵敏度:在甘油三酯浓度为2.26mmol/L时的吸光度不低于0.25。
7.1.2 特异性:试剂的配方设计和测定方式应可减小血清中的乳糜颗粒、胆红素、抗坏血酸等还原性物
质、血红蛋白等有色物质的干扰物质。
7.2 精密度和准确度的评价
无论选用何种原理测定甘油三酯的酶试剂,均应对其适用性、线性范围、检测限、灵敏度、特异性等
进行评价。选用的分析系统(试剂、校准物质和仪器)应在评价并保证其精密度和准确度之后用于病人
样品分析;应用中的分析系统应监测和保持其精密度和准确度。应尽量选用分析结果可溯源至公认参
考系统(见附录B)的分析系统。可应用二级参考物质或参考测量程序评价准确度。选用的分析系统的
测定结果与参考测量程序测定结果之间的相对不准确度(相对偏差)小于±5%。
7.3 质控限的建立和应用
在精密度和准确度评价符合要求后,选用的分析系统测定拟用作质控物质的血清⒛次~30次,计
算测定结果的变异系数应小于5%。
利用获得的数据按一定的质控方法建立质控限,用以判断样品测
定结果的有效性和监测测定质量的长期保持情况。质控值应在质控限以内,否则应分析原因后重新
测定。
7.4 室间质评
从事血清甘油三酯测定的实验室都应参加国家或地方室间质评计划。
7.5 精密度和准确度的再评价
在质控值保持正常的情况下应每年至少进行一次准确度评价。在改变试剂、校准物质或仪器设备
的种类或质控值持续出现超出质控限的随机误差或系统误差时应进行精密度或准确度再评价。
8 结果报告
应以我国法定计量单位mm。l/L报告甘油三酯测定结果,需要时,另外给出传统单位mg/dL结果
(1mmol/L=1mg/dL× 0。01129)。
以mmol/L为单位的结果保留小数点后2位有效数字。
检验报告应注明医学决定水平,需要时,另外注明参考区间。甘油三酯降低或升高的判断,需考虑
分析变异、个体内生物学变异及检验次数等因素。
Ws/T355— 2011
附 录 A
(资料性附录)
我国人血清甘油三酯水平高低划分方案
血清甘油三酯是一项重要血脂指标,除用于分析机体甘油三酯代谢状况和高甘油三酯血症的诊断
外,还用作心血管病危险因素指标。我国人血清甘油三酯水平商低划分方案(根据人民卫生出版社
2007年出版的《中国成人血脂异常防治指南》),我国人血清甘油三酯水平高低划分为合适水平:
(1.70mmol/L(150mg/dL);边缘性升高:l。70mmol/L≈2.25mmol/L(150mg/dL~199mg/dL);
升高:≥2.26mmol/L(200mg/dL)。
注1:不同地区不同人群的血渚甘油三酯参考值因环境与遗传因紊而异,不能笼统地指定所渭“正常值及正常范
围”。甘油三酪水平高低的划分方案根据冠心病流行病学研究资料及临床经验制定。
注2:我国人血清甘油三酯的个体内生物学变异约zB%,个体间生物学变异约56%。
Ws/T355— 2011
附 录 B
(资料性附录)
血清甘油三酯测定的参考系统
B,1 甘油三酯参考系统的组成
B.l。1 参考物质
美国国家标准与技术研究所(NIST)有一级参考物质三软脂酸甘油酯SRM1595(三软脂酸甘油
酯,纯度99.5%);我国有甘油标准物质GBW O9149。
二级参考物质有美国NIST的SRM1951a和
CDC的多种冰冻血清;我国有血清总胆固醇、总甘油、游离甘油和甘油三酯标准物质GBW O9145、
GBW O9146、GBW O9147、GBW O9148。
B.1.2 参考测旦程序
美国NIsT的参考测量程序是基于ID/MS原理的甘油三酯测定法和总甘油测定法。美国疾病控
制与预防中心(CDC)的甘油三酯参考测量程序一部分是二氯甲烷提取-硅酸吸附-变色酸显色甘油三酯
测定法,另一部分ID/MS游离甘油测定法。欧洲甘油三酯参考测量程序主要是ID/MS总甘油测定法。
我国是高效液相色谱测定总甘油和游离甘油的方法。
B。2 参考系统的应用方式及应用范围
参考系统的应用方式包括应用参考物质或应用参考测量程序。甘油三酯参考系统主要应用于以下
方面
:
——分析系统的溯源和质量评价
;
——酶试剂的制备及质量评价
;
——校准物质的制备、定值及质量评价
;
——新常规方法的发展及评价
;
——室间质评计划中的靶值确定
;
——协作研究中血脂分析的质量保证。
Ws/T355— 2011
参
考
文
献
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