流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

· ICs 11,o2o C50 中华人民共和国卫生行业标准 Ws/T360ˉ ˉ·2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群 GuideⅡnes for peripheraI Iymphocyte subsets by now cyt。metry 指南 2011-12-14 发布 中华人民共和国卫生部 发布 2012-o6-o1 实施 WS/T360—ˉ2011 曰 本标准按照GB/T1.1— ⒛09给出的规则起草。 本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。 本标准主要起草单位:中国医学科学院北京协和医院。 本标准主要起草人:崔巍、黄春梅、王斐、杨卓、陈倩。 亠 刖 VVs/T 360-ˉ 2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 l 范围 本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群(T细胞、B细胞、NK细胞、CDl T细胞和 CD8+T细胞)的技术要点,包括标本采集和运输、免疫荧光染色技术、流式细胞仪检测和分析、结果报 告和审核等方面。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 分化抗原 cIuster of differentiation,CD 不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中,出现或消失的细胞表面标志。细胞表面标志通常用单克 隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号,能被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号,例 如,被“CD1抗体”识别的抗原称为“tlDl抗原”。 2.2 目亍向散身寸光 forward ang【e Iight scatter FALs、FsC、Fs 光学检测器在人射光的正前方所收集的低角度光信号,勹细胞或颗粒的大小和体积有关。 2.3 侧向散射光 side× atter,ssC 光学检测器在人射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或颗粒的内部和表面结构复杂 程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规则性及核形等。 2,4 亥乏爿‘强店芰 fluorescence intens"y 结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件 下,荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关。 2.5 自发荧光 autofIuorescence 未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生,白发荧光的强度取决于激发光的 波长,且随所分析细胞的类型和(或)细胞活化状态而改变。通过特殊的标本处理方法可以降低白发荧 光的强度(如丿|j结晶紫孵育)。 2.6 颜色补偿 coIor compensation 由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光佶号重叠,通过在其 他荧光信弓巾扣除已测定荧光信号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当 的单染对照来确定的.被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。 2.7 以芝门 gate 在流式细胞仪显示的象限图上基于一组参数(女口荧光对sSC.「sC/sSC等)来确定的所要分析的目 l Ws/T360-2011 的细胞群.又寸限定区内的目的细胞群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。 2.8 双平台方法 duaI-pIatform methodi DP 用于流式细胞术测定细胞绝对计数的一种方法,结果来源于流式细胞仪和第二种仪器的检测。第 二种仪器通常是血细胞分析仪。流式细胞仪用于获取出现于较多量靶细胞群中的目的细胞亚群的比 例,靶细胞群通常是淋巴细胞群或白细胞群。用第工种仪器分析同一标本靶细胞群的绝对浓度ε这两 个测定结果相乘所得即为目的细胞群的绝对浓度。该方法的缺点是包含两种体系的系统误差。 2,9 单平台方法 single-platform method,sP 用于流式细胞术测定细胞绝对浓度的一种方法,所有结果均来自流式细胞仪一台仪器的测定。浓 度的测定可以直接通过测定体积的方法或问接的通过加入已知浓度的荧光微球来计算。单平台方法免 去了第二台仪器的所产生的系统误差。 3 试剂 3,1 荧光素标记的单克隆抗体 采用荧光素直接标记的单克隆抗体(单抗),称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关 键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反应性。 3。1.1 单抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。 3.1.2 单抗对细胞的反应性 CD45表达于所有白细胞;CD3表达于T淋巴细胞;CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细 胞)和单核细胞;CD8表达于细胞毒T细胞(CD8· T)和NK细胞;CD19表达于B淋巴细胞;CD16表达 于NK细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等;CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。 3.1.3 单抗对淋巴细胞亚群的鉴定 CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。采用CD45和(或)CD3作为 设门抗体,同时兼做质控试剂。CD3_T细胞标记为CD3_,CD4ˉ T细胞标记为CD3÷ CD4ˉ ,CD8ˉ T 细胞标记为CD3ˉ CD8+,B细胞标记为CD3CD19_,NK细 胞标记为CD3CD56+或CD3CD(16+ 56),。 3,1,4 直标抗体常用荧光染料 异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE/RD1)、藻红蛋白偶联物(PECY5)、多甲藻叶绿素蛋白 (Pe￡P)、藻红蛋白-德州红偶联物(ECD)和别藻青蛋白(APC)。 除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染 料均采用488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最大发射波长为660nm。 3.2 溶血素 使用与仪器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用 没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4℃,并在1h内完成上机 2 Ws/T 360-ˉ 2011 检测。 3.3 定量微球 用于淋巴细胞亚群绝对计数。常用的商品化荧光微球包括Flow-C。untTM(Beckman~Cou1ter)、 FCSC Count StandardtM(Flow C~vt° metry Standards Corporaton)和 TruCountTM(Becton Ekkns° ω等。 4 标本采集和处理 4.1 生物安全 血液和体液标本中可能存在致病性甚至致死性的活体病原微生物,所有标本都应当作潜在传染源 来处理。 4.1.1 标本采集 避免被针头刺伤,针头丢弃人利器盒中,严禁复帽、弯曲、折断针头或者从注射器上取下针头。 4.1,2 安全着装 所有接触血液标本的人员都应戴手套、穿实验室工作服。当标本处理过程中有飞溅的可能性,应带 好口罩和防护眼罩,避免眼、口、鼻等部位接触标本。在所有工作结束后和离开实验室前,应脱掉手套并 洗手。 4.1.3 生物安全柜(BsC) 所有的操作都应该在生物安全柜中进行(I类或Ⅱ类BSC);即使条件不允许,对于可能产生微粒 或气溶胶的操作(如涡旋、打开真空管等)仍需要在BSC中进行。 4.1.4 离心 标本离心时需要放在封闭的容器中,避免气溶胶形成。 4.1.5 吸旦 应用手工或电动移液器,严禁用嘴吸量。 4.1.6 利器 避免使用利器,如针头、玻璃巴斯德移液管、玻璃容器等。 4.1.7 血液溢洒 血液溢洒时,立即用合适的试剂擦拭干净,如1:10稀释的新鲜配制的0.71mol/L次氯酸钠(未稀 释的家用漂白剂)或适当稀释的医用消毒剂。 4.1.8 废弃物处理和标本灭活 实验室废弃物处置的管理应符合国家、地方的相关要求,所有不再需要的标本和其他生物材料应弃 置于套有生物危险标志的黄色密封且防漏的塑料袋的容器内,用过的针头等利器应放人利器盒中。 实验室标本需要事先灭活处理,将标本与广谱碘伏和漂白剂混合作用24h后再进行适当处理。由 于漂白剂与氯化铵作用可产生有毒的氯气,故漂白剂不能用于处理含有氯化铵的溶液。 3 Ws/T360-— 2011 4.1.9 固定液 0.1%~2,0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够 灭活HⅣ等病毒的3个~5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛 或甲醛缓冲液(pH7,0~7,4)处理,4℃保存待测。建议每周配置新鲜的多聚甲醛或甲醛缓冲液。使用 含有罔定液成分的商品化裂解液时,无需再重复使用多聚甲醛或甲醛缓冲液。 4.1,10 非固定标本 对于非固定标本,实验室应制定合适的生物安全规则以将感染病原体的暴露降到最小。由于暴露 在空气中的流式细胞仪液流系统产生的气溶胶具有潜在的危险,所以应提高警惕,严格按照制造商的生 物安全建议进行操作。 4.1.ll 设备消毒 流式细胞仪的废液桶中需要装有占其体积1/10的0.71mol/L次氯酸钠(未稀释的家用漂白剂)。 实验室设备应该用具有灭活传染源作用的溶液或新配制的10%家用漂白剂消毒,尤其在设备维修和保 养前给予严格消毒。 4.2 标本标识 所有检测用标本应及时贴上标签,标签上应注有患耆的姓名、患者唯一的识别码、检测项目、标本采 集的日期和时间,必要时标注检测实验室。如果使用检查申请单,申请单应和标本粘贴在一起送检,申 请单上应标明患者的姓名、检测项目、年龄、性别、标本采集日期和时间、申请医生的姓名和标本类型 (如:全血),必要时标注检测实验室。 4.3 抗凝剂和采集容器 首选乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝真空管进行标本采集,亦可采用肝素钠抗凝或枸 橼酸钠抗凝(ACD)的真空管进行采集,EDTA盐抗凝标本在室温下稳定保存12h~24h,超过30h的 EDTA盐抗凝标本中粒细胞可能会减少,肝素钠或枸橼酸钠抗凝标本可稳定保存至48h。如果标本用 血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类,则应该选择EDTA盐作为抗凝剂。 4.4 标本质量 4.4.1 标本目视观察 可观察到的标本问题常见有两种类型:一是变性或损坏的标本,这需要立即弃之。二是在标本处理 过程中出现错误操作,这需要进行进一步评价。错误操作问题需要记录下来,这对标本的处理、分析以 及结果的解释都很有帮助。 4.4.2 溶血 严重溶血的标本应该放弃检测,所有可能破坏标本完整性的异常情况均应密切观察,并且记录下 来,以利于后续的处理、分析和结果解释。 4,4.3 凝血 即使是很小的血凝块也会引起血液中某些成分的选择性丢失或改变,凝血的标本尽可能弃用。 4.4.4 温度极限 如果标本是通过长距离的路程送到实验室的,标本就有可能暴露在非允许储存温度的环境中,所以 4 、Vs/T 360-ˉ 2011 接到标本后应确认标本是否过热或过冷。即使其他所有的鉴定标准都正常,也应记录下来以利于后续 的处理、分析和结果解释。 4.4.5 错误标本标签 如果标本没有唯一标识或标本标签与患者信息不符(患者姓名与标识不符),应该拒收标本,并及时 与相关医护人员沟通。 4.4.6 标本保存时间及储存条件 可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、溶血剂、储存条件及细胞浓度。实验室应该根据 使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。实验室应选择适当的保存环境以及溶血方 法,使保存标本的检测结果与新鲜标本之间没有明显差别。原则上标本采集后应该立即检测,但是实际 操作中往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于室温(18℃~25℃)环境中。后续的标本处理 和免疫染色应严格按照试剂说明书进行。 4,4,7 标本处理方法 采用全血溶血法,以便尽可能地回收所有的白细胞。但对于慢性肝病或高脂血症等患者的标本,由 于脂质代谢异常导致红细胞脆性下降,溶血素常常无法完全裂解红细胞,需要采用密度梯度离心法;但 需要注意的是密度梯度离心法使用密度梯度或冗长的离心步骤,容易导致特殊亚群的不均匀丢失。 标本处理的步骤越多,细胞丢失就越多。而这种丢失在白细胞分类中的比例是不均等的。对于全 血标本,溶血后不能洗涤,这可以使标本处理的步骤减到最少。 4.5 标本运送 4.5.1 内部送检 同一实验室内转移血液标本,盛放血液标本管的容器应标有生物危险标志,并且在血液标本管有破 损的情况下,仍能够容纳标本,可用具有防漏密封层的塑料袋或带有安全盖的塑料容器等。 4.5.2 外部送检 危险物品运送规定和国际航空运输协会(IATA)危险品规则对含有致病原血液标本的运送均有相 关规定。HIV已被列为UN2814类危险物质,感染级别为6.2。包装应符合UN6.2级别高致病菌性病 原体的安全运输包装标准,标准包装要求含有三层体系 : a) 防水内容器 ; b) 防水并含有吸附材料的第二层内容器 ; c) 坚固的外包装。 采集标本应在室温(18℃~25℃)环境下尽快送检。 5 细胞绝对计数方法 5,1 单平台方法 5.1.1 白细胞浓度和抗体用且 通过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标本中的白细胞浓度,并严格按照操作说明书调整 标本和抗体的最佳比例。淋巴细胞过少的标本应减少单抗用量。淋巴细胞过多的标本应使用含l%白 蛋白或其他蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释到适当浓度。 Ws/T 360-ˉ 2011 5.1.2 移液量 标本和荧光微球的移液量应精确,确保准确计数加人的定量微球的浓度和标本体积。 5.1.3 移液次数 使用包被有已知数量的荧光微球的标本处理管,只需移液一次;而直接在标本中加人已知浓度的荧 光微球悬液,需要移液两次。 5.1.4 离心 为避免荧光微球的丢失,在裂解细胞后不要离心洗涤。 5.2 双平台方法 淋巴细胞亚群绝对计数由全血细胞分析仪测定的白细胞计数计算得到,不能使用淋巴细胞计数进 行计算。 单平台方法是首选方法,它减轻了室间变异并避免了多台仪器间的系统误差。 6 免疫荧光染色 6.1 抗体组合方案 6.1.1 联合CD45的四色方案 6.1.1.1 CD45/CD3/CD4/CD8 检测CD3卞T细胞、CD4+T细胞和CD8十T细胞。 6.1.1.2 CD45/CD3/CD19/CD16和 (或)CD56 检测CD3· T细胞、B细胞和NK细胞。 6.1.2 联合CD45的三色方案 6.1.2.1 CD45/CD3/CD4 检测CD3TT细胞和CD4亠T细胞。 6.1.2.2 CD45/CD3/CD8 检测CD3+T细胞和CD8+T细胞。 6.1.2.3 CD45/CD3/CD19 检测CD3· T细胞和B细胞。 6.1.2.4 CD45/CD3/CD16和 (蓟DCD56 检测CD3+T细胞和NK细胞。 6.1.3 双色方案 6.1.3.1 CD3/CD4 检测CD3+T细胞和CD4+T细胞。 6 Ws/T 360-ˉ 2011 6.1.3.2 CD3/CD8 检测CD3ˉ T细胞和CD8ˉ T细胞。 6,1.3.3 CD3/CD19 检测CD3ˉ T细胞和B细胞。 6.1.3.4 CD3/CD16和(蓟DCD56 检测CD3ˉ T细胞和NK细胞。 当检测条件不允许时,也至少要采用CD3与其他直标抗体进行双免疫荧光染色的方案,简称双色 方案。不能使用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。 6.1.4 ⒎氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案 对于超过24h的标本或肉眼观察发现已经变质的标本,使用7-氨基放线菌素D结合CD45(评估淋 巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡)复染进行细胞活力的评估。⒎AAD阴性者为活细胞群,⒎AAD阳性 者为细胞膜不完整的死细胞群。对于不可替代的或活力较低的标本,应采用7-AAD结合6.1.1或 6.1.2或6.1.3的组合方案。 6.2 免疫荧光染色 6.2.1 标本与抗体孵育 适量体积(50uL~⒛0uL)全血标本加人适量直标抗体(10uL~20uL),室温孵育时间20min~ 30∏1in。 6.2.2 裂解红细胞 裂解红细胞的方法与使用的溶血素有关,裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。 6.2.3 离心 离心洗涤方法与溶血素有关,按照所用溶血素说明书进行操作。单平台绝对计数法在裂解红细胞 后,不要离心洗涤,并在上机检测前向待测标本中加人定量荧光微球。 6.2.4 染色后标本保存 制备好的标本在上机分析前在40℃~1o℃下避光保存,并在24h内上机检测,检测前混匀细胞。 推荐使用商品化组合抗体的体外诊断试剂。如实验室自已准备组合单抗,要求在每次试验前新鲜 配制。组合抗体中每一种抗体都需要分别滴定以明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度,并检测作为 组合抗体使用和作为组合抗体的成分之一单独使用的平均荧光强度和阳性率,其可比性需在均值 ±2SD之内。 7 对照标本 7.1 同型对照 淋巴细胞亚群分析不需要同型对照,这是因为CD3、CD4和CD8阳性细胞独立成群,与阴性细胞群 容易区分。 、Vs/T 360-ˉ 2011 7.2 针对方法学的阳性对照 7.2.1 目的 监测流式细胞仪上机分析前的环节是否出现问题。由于某种疾病导致方法学阳性对照的结果在参 考范围之外,不会造成同时处理的其他标本的检测结果出现错误。由于裂解红细胞不完全或染色效果 差,包括阳性对照在内的所有标本都会出现结果偏差。 7.2.2 种类 全血标本、商品化荧光微球试剂。 7,2.3 使用频率 每次上机时都需要使用。 7.3 评价试剂的阳性对照 7.3.1 目的 检测新批号试剂和当前批号试剂的染色效率是否出现问题。当怀疑试剂出现问题时,采用该试剂 与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。 7.3.2 种类 全血标本、冻干淋巴细胞。 7.3.3 使用频率 更换试剂前后。 8 流式细胞仪的质虽控制 8.1 验证和调整光路及规范光路设置 8.1.1 电压和增益 在每次开机时,首先采用荧光微球光路质控品设置和调整仪器光学检测通道的电压和增益,确保其 处于厂家或实验室根据特定的实验状态所设定的可接受范围内,并且保持每次开机时仪器性能稳定,对 荧光抗体或全血标本最适合。 8.1.2 峰值及变异系数 调整散射光峰和荧光峰,使之置于相应通道的同一狭小范围内,要求所有光学检测通道所使用的光 学参数和荧光参数均为均质峰,其变异系数应符合所用流式细胞仪的技术要求。 8.1.3 仪器设置的标准化 连续5d上机测定荧光微球在每个光学检测通道的平均通道数和变异系数(CV%),每天共测定 4次,然后计算出这些参数的均数(Ξ)及标准差(SD),以Ξ±2SD为可接受范围。当出现偏差时,应查 找和解决问题,再进行光路的重新调整。维持上述的仪器设置条件,用于后续的仪器敏感性和荧光补偿 设置的监测。 8 、VS/T 360-ˉ2011 8,2 调整荧光分辨率 8,2.1 光路电压 采用未加直标抗体但经溶血素裂解的新鲜全血标本调整光电倍增管(PMT)电压。未染色淋巴细 胞的自发荧光应完全在阴性区域,所使用的检测通道内荧光直方图的淋巴细胞阳性率<2%,双荧光散 点图内的未染色细胞位于散点图的左下象限内。 保持与检测临床标本时相同的PMT电压设置,用已知相对荧光强度的荧光微球上机测定,如仪器 厂商提供的标准品。通过连续5d、共⒛次的重复测定得到每一种荧光微球的可接受平均荧光强度范 围。要求每一种荧光微球的平均荧光强度检测值,其相关系数应≥0,98。 在仪器PMT电压不变的情 况下,各种荧光微球的荧光线性、平均荧光强度差异应保持不变。荧光线性图的绘制遵从制造商的 建议。 8.2.2 弱表达和自发荧光 评价标准品或校准品或细胞对弱表达荧光与自发荧光的区分能力。 8.2.3 峰间变异系数 确定峰间最小的可接受数据,监测此差异并校正任何日常偏差。 流式细胞仪应使每个荧光检测通道都能将弱表达峰和自发荧光峰区分开,每月进行一次或按照仪 器制造商的推荐周期执行。 8.3 调整荧光补偿 8.3.1 目的 当采用两种及以上抗体组合方案进行淋巴细胞亚群分析时,或当光学检测通道的电压及增益发生 变动时,或当仪器维修保养后,都需要进行荧光补偿调整。 8.3.2 方法 8.3.2.1 荧光补偿试剂 选择与最强荧光信号相匹配的补偿试剂。三色抗体组合分析时,通过含有荧光微球或细胞补偿颗 粒的4个单标记标本管调整补偿,包括无直标抗体标本管、仅含FITC直标抗体阳性标本管、仅含PE直 标抗体阳性标本管、仅含第三种直标抗体阳性标本管。四色抗体组合分析时,需要在三色抗体组合分析 的基础上,增加仅含第四种直标抗体阳性标本管。 8.3,2.2 三色组合方案的荧光补偿 三色抗体组合分析时,补偿应按适当的顺序进行,依次为FITC、PE和第三种荧光。将不应该是两 种荧光抗体双阳性的细胞群调整到相应的直角荧光象限中,使双阳象限中无荧光重叠。避免过度补偿 , 以防将双阳性细胞错误地识别为单阳性细胞。 8.3.2.3 四色组合方案的荧光补偿 按照操作说明书执行,避免过度补偿。可以采用手工方式,也可以采用软件自动补偿方式。 8,4 性能评估 8。4.1 准确度 通过将自己实验室的检测结果与参考实验室的检测结果进行比对获得。 Ws/T 360-2011 8.4,2 特异度 每个实验室需要就流式细胞术检验结果与参考方法(如免疫荧光染色法)检验结果的偏差,建立实 验室内部可接受的偏差率。推荐可接受偏差率为5%,每3个月进行一次特异性检测。 8.4.3 灵敏度 依赖于单抗滴度、仪器最佳性能状态的建立与仪器校准、检测细胞数量和细胞进样速率等。抗体滴 定的测试、新使用抗体的平行测定都是需要的,并要求做好相应文件记录。 8.4.4 精密度 用于衡量单份标本荧光染色的可重复性和仪器的可重复性。推荐使用正常外周血。荧光染色的可 重复性要求对同一份标本测定≥10次,并以均数(I)及标准差(SD)表示,以Ξ±2SD作为允许波动范 围。仪器可重复性的检测要求对同一份染色标本进行≥3次的测定,要求检测结果在Ξ±2SD范围内。 每个实验室需要建立评价准确度、特异度、灵敏度和精确度的办法和标准。 8.5 比对 8.5.1 目的 实验室有多台流式细胞仪都进行外周血淋巴细胞亚群检测时,要求每半年进行一次仪器性能间 比对。 8.5.2 方法 选择5个~10个临床标本,按照实验室标准操作规程(SoPs)对标本进行染色处理和上机测定,不 同仪器间的检测结果应达到实验室制定的可接受区间。如结果超出可接受区间,需要分析原因,按照实 验室制定的校正程序对结果进行纠正。 8,6 仪器质控日志 保存仪器质量控制日志,持续监测所有参数的变化。在日志中记录仪器设置、峰值通道、监测仪器 状态的变异系数(Cη 、标准化、荧光分辨率和荧光补偿等数据。绘制成Lev「Jennings图,每月打印进 行保存。当这些数据出现偏倚或仪器被维修保养后,需要重新建立散色光和荧光参数的靶值。 8.7 仪器维护 仪器整体保养半年一次,由厂家工程师协助完成。光电倍增管(PMT)每月检测一次,由厂家工程 师协助完成。 9 标本和数据分析 9.1 验证可接受的标本活力 9.1.1 目的 染色过程中产生假阳性的主要原因是没有活力的细胞的干扰,因此每个实验室都应该建立一套方 法来评估经过处理和染色后的标本活力。当标本放置超过24h后或出现肉眼可见的细胞坏死征象(女口 细胞碎片增多、标本浑浊等)时,需要检测染色后的标本活力。 10 Ws/T 360-ˉ 2011 9,1.2 方法 见6.1。芝。 9.1.3 判定标准 将7AAD阴性细胞群计数为75%时称为最低细胞活力。对于低于75%的细胞活力的标本,采用 6.1.4方案。 9.2 取样代表性 9.2.1 标本混匀 为了避免不同血细胞沉降速率引起的人为误差,标本在上机前应充分混匀。 9.2.2 取样代表性判断 当染色标本的光散射特征出现异常时,考虑与取样的代表性有关,因为反应染色细胞大小和密度差 异的光散射特性会影响相对细胞沉降速率。 9.2.3 取样代表性验证 通过比较同一标本充分混合后的分析结果与放置一段时间后(相当于标本分析的最长预期时间)的 分析结果,来验证取样是否均一,以充分混匀的标本的分析结果为准。 9.3 联合CD45和ssC设门确定淋巴细胞群 9.3.1 设定阈值或分辨值 根据仪器操作说明书进行设定。 9.3.2 调整细胞群分布 在CD45/SSC散点图中,调整SSC,使所有白细胞群均可见。 9.3.3 根据CD45强阳性细胞群设门或划定区域(见附录A) 淋巴细胞群呈现CD45强阳性和SSC弱表达,设门时尽可能包括所有淋巴细胞,门内淋巴细胞数不 低于95%,并排除单核细胞和嗜碱性粒细胞的干扰。 相对于淋巴细胞,单核细胞的CD45呈弱表达,而SSC呈中等强度表达;嗜碱性粒细胞的CD45和 SSC均为低表达。 9.3.4 采集细胞数 在非设门荧光散点图中,每一荧光通道至少收集5000个淋巴细胞,以确保对数量较少的淋巴细胞 亚群(如占总淋巴细胞数的10%)提供足够多的细胞。 9.3.5 T、B和NK细胞相对计数的总和 占淋巴细胞总数的100%± 5%范围内。 9.3,6 T细胞、B细胞和NK细胞在CD45/ssC散点图中的分布和确认 B细胞的CD45表达较T细胞稍弱,NK细胞的CD45表达强度与T细胞相似,但SSC信号较T细 11 Ws/T360-2011 胞强。 将CD3/SSC,CD19/SSC,以及CD56或CD(16+56)/SSC中T细胞、B细胞和NK细胞的分布特 征筛选出来,并在CD45/SSC双参数散点图中显示,以监测设门的准确性。 定位淋巴细胞群是淋巴细胞亚群分析的第一步,并排除标本中非淋巴细胞或细胞碎片对淋巴细胞 群的干扰。 9.4 淋巴细胞亚群分析和计数(见附录A) 9.4.1 双参数荧光散点图的设置 设置CD3/CD在散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD19散点图、CD3/CD56或CD(16+56)散点图。 9.4.2 四象限门的设置 在每一荧光散点图中,设置四象限门,将CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群中的表达该抗原 的阴性细胞群和阳性细胞群区分开来。 9.4.3 淋巴细胞亚群相对计数 9.4.3.1 CD4+T细胞相对计数(百分比,%) CD3/CD4散点图中CD3_CD4+双阳性细胞群占CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群的百 分比。 9.4.3.2 CD8+T细胞相对计数(百分比,%) CD3/CD8散点图中CD3ˉ CD8+双阳性细胞群占CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群的百 分比。 9.4.3.3 B细胞相对计数(百分比,%) CD3/CD19散点图中CD3CD19+细胞群占CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群的百分比。 9.4.3.4 NK细胞相对计数(百分比,%) CD3/CD56或CD(16+56)散点图中CD3CD56ˉ 细胞群或CD3CD(16+56)ˉ 占CD45/SSC散 点图中选定的淋巴细胞群的百分比。 9,4,3.5 CD3+T细胞相对计数(百分比,%) 在上述任意散点图中均可计数,在CD3/CD4散点图中计数为CD3+CD4单阳性细胞群百分比和 CD3÷ CD4÷ 双阳性细胞群百分比的总和,在CD3/CD8散点图中计数为CD3+CD8单阳性细胞群百分 比和CD3+CD8+双阳性细胞群百分比的总和,在CD3/CD19散点图中计数为CD3÷ CD19ˉ 细胞群百分 比,在CD3/CD56或CD3/CD(16+56)散点图中计数为CD3· CD56ˉ 或CD3ˉ CD(16+56)百分比和 CD3+CD56ˉ 或CD3+CD(16+56)+百分比的总和。 9.4.4 淋巴细胞亚群绝对计数 9.4.4.1 双平台方法 根据9.4.3方法检测的淋巴细胞亚群相对计数,通过双平台方法计算出绝对计数(绝对值,× 106/D。 白细胞计数需要与亚群分析使用同一标本进行测试,并在6h内完成。当白细胞计数不能准确获得时, 12 Ⅵ/s/T360-2011 不能用双平台方法进行淋巴细胞绝对计数,只能采用单平台方法。不能采用淋巴细胞计数来计算淋巴 细胞亚群绝对计数,因为淋巴细胞计数在血细胞分析仪上表现出更大的变异度,白细胞计数作为分母比 淋巴细胞计数更为稳定。 淋巴细胞亚群绝对计数(绝对值)=q哭彘甏毒卷焉筹罨笋× 9.4.4.2 单平台方法 淋巴细胞亚群绝对计数直接来源于流式细胞仪数据,由专用软件直接计算生成,详见试剂操作说 明书。 9.5 数据分析可靠性的验证 9.5.1 CD45 在三色和四色抗体组合方案的每一检测标本管中均存在,在对淋巴细胞群进行设门的同时,也具有 监测和评估标本管间变异性的作用。 9.5.2 CD3 在四色抗体组合方案和双色方案的每一检测标本管中均存在,标本管间CD3+T细胞计数的重复 结果间的差异应≤3%。 当CD3在某一标本管中的计数与其他标本管之间的差值>3%时,应重做该管 标本,包括重新染色、裂解红细胞和固定等。 θ.5.3 CD4+T细胞和CD8+T细胞相对计数的总和 CD4÷ T(CD3· CD4_)细胞和CD8ˉ T(CD3+CD8t)细胞百分比的总和应该等同于CD3+T(CD3ˉ ) 细胞的百分比,变化范围在5%~10%。 当结果超过上述控制范围时,考虑标本中可能包含大量异常T细胞亚群,如TC艮γδ+T细胞, CD3+CD4ˉ CD8^或CD3+CD4+CD8由mT细胞。 9.5.4 定旦微球采集时间的稳定性 用于单平台方法评估绝对计数的准确性。采集时间恒定,提示流式细胞仪的液流系统通畅,定量微 球的加人量准确。采集时间不恒定,提示标本制备过程中出现问题,需要重新制备标本。 10 临床意义 10.1 CD4+T细胞 减少常见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂等。 10.2 CD8+T细胞 10.2.1 增多 见于系统性红斑狼疮、慢性活动性肝炎、传染性单核细胞增多症、恶性肿瘤及其他病毒感染等。 10.2.2 减低 见于类风湿性关节炎、糖尿病等。 13 、Vs/T 360-ˉ 2011 10.3 CD4+T/CD8+T比值 10.3.1 降低 见于传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、再生障碍性贫血、骨髓移植恢复期、肾病等,艾 滋病患者的CD4ˉ T/CD8_T比值多在0.5以下。 10.3.2 增高 见于移植后发生排异反应、类风湿性关节炎、糖尿病等。 外周血淋巴细胞亚群是监测机体免疫功能的重要指标,主要用于免疫系统疾病及免疫相关疾病诊 断和治疗的临床监测。T细胞亚群与细胞免疫功能有关,B细胞与体液免疫功能有关,NK细胞与非特 异免疫功能有关。 ll 结果报告和审核 l1,1 报告内容 CD3ˉ T细胞、CD4ˉ T细胞、CD8ˉ T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数(百分比)、绝对计数(绝对 值)、CD4ˉ T/CD8ˉ T比值、参考范围及必要的解释和分析。 li.2 审核内容 包括数据采集阈值的设置、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案、与试验结果相关的所 有设门等。这些数据均应由实验室专业人员在解释数据时进行审核。 ll。3 参考范围 每个实验室针对每一型号仪器都应确定本实验室淋巴细胞亚群分析的参考范围,成人和儿童应分 别建立参考范围。并每年进行验证和调整,每次验证不少于⒛例健康人标本。 12 数据储存 12.1 储存内容 数据储存和检测数据的方法都应该详细记录,以便于检测者或医师对数据进行复核。对所有要分 析的标本数据采用列表模式储存起来,以确保对原始数据进行全面分析。对每个标本的CD45/SSC淋 巴细胞群设门图和显示淋巴细胞亚群的荧光散点图的分析结果应保留纸质文件。数据也可以保存为电 子版,但应该做好备份以免硬件或软件出现故障导致患者数据丢失。室间质评和室内质控数据应该包 括评估检验系统(仪器和方法)性能的所有参数、分析区域和分析结果。 12.2 储存类型 数据储存方式多种多样,这主要取决于实验室所用的信息系统,包括软盘、移动硬盘、光盘和磁带。 如果数据以纸质文件的形式储存,那么得出报告结果的所有图形和分析区域(例如淋巴细胞设门、分析 界限等)都应记录在相应的数据表中,而且每个标本的数据表都应该有唯一标识。 12.3 储存期限 至少保留2年,或根据实验室要求保留较长时间。储存期过后,实验室监督人员有权利决定继续保 14 Ws/T 360-ˉ 2011 留或删除数据。 13 室内质量控制 实验室应开展室内质量控制工作,考虑到中国国情和质控品的成本较高,建议每月至少进行室内质 控检测一次。对于特殊实验,如艾滋病CD4ˉ T细胞计数,建议至少每周进行一次室内质控的检测。进 行室内质控品检测前,首先采用健康志愿者的新鲜外周血标本作为质控物上机测定,一般需要做重复 测定。 14 室间质±评价 实验室应参加国内或国外质评机构组织的室间质量评价和能力验证(PT),用于能力验证的样本必 需与病人标本同等对待,要求检验人员和检验流程完全一致。能力验证的检测结果不能与其他参加能 力验证的实验室进行讨论。用于能力验证的样品在任何情况下都不允许转送其他实验室检测或赠与其 他实验室。如发生任何失控问题,应积极采取纠正措施预防其再次发生,并记录所有质量保证活动。实 验室需要对能力验证时样本的接收、检测前处理、检测、检测后分析与解释、及检测报告等相关资料进行 保存。 15 人员培训要求 流式细胞分析室应具有监督人员和操作人员岗位,并制定用于培训的标准化操作规程(SOP)。 实 验室监督人员对每一位操作人员的培训效果、流式细胞术检验能力进行考核并决定是否授权上岗。监 督人员和操作人员应完成流式细胞仪厂家的基本培训以及专业操作培训班的定期培训,并跟进政府或 地区对培训和教育的政策措施。 Ws/T 360-ˉ 2011 附 录 A (资料性附录) 四色抗体组合方案进行淋巴细胞亚群分析的示意散点囡 Φ 叫 ° 0 0 〓 ° 0 0 0 ∞ 曩 黪 ˉˉ E馕曩桊 I CD3 l { ˉ ˉ ˉ △ˉ ˉ ˉ ^ˉˉ ^ˉ ˉ ˉ ˉ |∶ i∶|啻宫 :蕞饔 髯 襄 | CD3 寸 ° O b) a) ∞ ° 0 d) 曰A。 1 第1管(A,B,O由CD3,CD19,CD45和CD56单抗组合染色,第2管(D,E,F)由CD3,Cm,CD8 和CD45单抗组合染色。 图A。1a):CD45和ssC非设门的白细胞散点图。在此散点图中设定阈值以排除CD45阴性的细胞 碎片,其中Ly代表淋巴细胞,Mo为单核细胞,Eo为嗜酸性粒细胞,Ne为中性粒细胞,Ba为嗜碱性粒细 胞,He为前B细胞,My为髓系早期造血细胞。 图A。1b)~D:双荧光散点图。在此散点图中,对图A。1a)门内的淋巴细胞亚群分析,其中也包含 少量的单核细胞。主要识别以下淋巴细胞亚群:CD3+T细胞亚群(CD3+T),CD3+CD4+T细胞亚群 (CD4+T),CD3+CD8+T细珏Ⅱ亚群(CDs+T),CD3^CD19+B细胞(B),CD3_CD56亠NK细胞(NK), CD3+CD56÷ T细胞(CD56+T),CD3ˉ CD8+NK细胞(CD8+NK),CD3ˉ CD8ˉ NK细胞(CD8ˉ NK)。 璎 匣 CD45 曩 婴 黠 CD8 一 一 一 一 一 曩 一 一 一︱ 丨 醐 黪 婴 CD3 CD4 、Vs/T 360-ˉ 2011 参 考 文 献 E1二 CDC,Nati° nal Insitutes° f Health.Biosa￡ety in microbi° l。gical and bi。mcdical lab° rat° ries. Fourth editi° n.Ⅵ⒎ashington】DC:US Government Printing()f￡ ice,1999 E21 Calvelh T,Denny TN,Paxton H,et al,Guideline for flow cytometric immunophenotyping:a rcport frorn the national institute° f allergy and infectious diseases,division° f/`IlDS.Cytometry.1993, 14:702-714 E3] Mandy FF,Nicholson JK,McDougal JS,CDC.Guidelines for performing singl⒍ platform ab~ solute CU4ˉ T-cell determinations with CD45gating f° r persons infected Ⅵ厂ith human immunodeficicn~ cy virus,卜ΙⅨ汀WR Rec。mn△Rep.2003,52(RR-2):1△3 E4] Paxton H,Bendele T.Effect of time,temperature,and antic° agulant on fl° wc” °metry and hematological values。/`nn N Y Acad Sci,1993,677:440-443 E5彐 Shield cF,IⅡ,Manlett P,Smith A,et a1.Stabihty of human lymphocyte differentiation anti~ gens when stored at r°om temperature.J Immunol Meth° ds。1983,62:347352 E6] Ekong T,Kupek E,Hill H,et a1.Technical influences on immunophenotyping by flow cy tometry.The effect° f time and temperature of storage on the viability of lymphocyte subsets.JImmu- n°l lMethods,1993,164:263-273 E7] Whitby L,Granger V,Storie I,et al。 Quality control CD4氵 T-lymphocyte enumeratlon:re sults from the last9years of the United Kingdom National External Quality Assessment Scheme for iⅡnnune monitoring(1993-2001),Cytometry。 2002,50(2):102-110 E8] Schnizlein~Bick CT,Spritzler J,WⅡkening CL,et al。Evaluation of TruCount absolute~count tubes for deter∏1ining CD4 and CD8 ceⅡ numbers in human iⅡuuunodeficiency virus~positive adults. Site investigators and the NIAID DAIDS new technologies evaluau。 n gr。up.Chn Diagn Lab In△m uno1. 2000,7(3):336-343 E9] Storie I,Sawle A,G° °dfellow K,et a1.Perfect count:a novel approach for the single platform enumeration of absolute CD4_ T-lymph° cyte.Cytometry B Chn Cytom,2004,57(1):47-52 [10] CDC。1997Re访sed godelines for perforluing CDd· T-cell determinatons in persons infected mth human innmunodeficiency virus(HIV).46(RR-2)。1997,Atlanta GA E11] Gelman R,WⅡke血ng C.Analyses of quality assessment studies using CD45for gating lymph° cytes for CD3(+)4(+)%。Cyt。metry。2000,42(1):⒈4 E12彐 Nkholson JK,Hubbard M,Jones BM,Use of CD45fluorescence and sid⒐ scatter characte⒈ istics for gating lymphocytes when using the whole blood lysis procedure and flow cytometry。Cytome- try,1996,26(1):16-21 E13] Nicholson JK,Jones BM,Hubbard M.CD4T-Iymphocyte determinatons on whole bl° od speci!nens using a single-tube three~color assay。Cytometry.1993,14(6):685-689 E14」 Schenkcr EL,Hultin LE,Bauer KD,et al。Evaluation° f a dual~color flow cyt° metry immu~ nophenotyping panel in a multicenter quahty assurance program。 Cytometry,1993,14(3):307-317 E15] Stewart CC.Clinkal applict/Lton of Ⅱ°wc疒ometry.Immunolo匪c methods for measurhg cell membrane and cytoplas∏1ic antigens。Cancer.1992,69(6 suppl):1543-1552 E16] Mandy F,Bergeron M,Houle G,et a1.Impact of the internatonal program for quality as sessment and standardizatlon for immunological measures relevant to HIV/AIDS:QASI。 Cytometry (Chnical Cyt° metry)2002,50:111-116 17 Ws/T 360-ˉ 2011 E17] Wayne PA。 Clinical applications of flow cyt° metry:quality assurance and immunopheno- typing of lymphocytes;approved guidehne(】H42-A)。 l町ati° nal ComⅡ1⒒tee for Chnical Laboratory standards。1998,18(21) E18彐 McCoy JP,Jr。,Carey JL,Krausc JR。 Quality c°ntr° 1in fl°w cyt°metry for dhgn°stic pa- thology。 I。Ce1l surface phenotyping and general laboratory procedures。 Am J Chn Pathol。 1999,93: S27-s37 E19] Gelman R,WⅡkening C。Analyses of quality assessment stu山es u“ng CD45for gating lymphocytes for CD3+4+%。Cytometry(Communications in Clinical Cytometry)2000,42:⒈4 E20彐 Gratama JW,Kraan J,Keeney M,et al。Enumeraton ofimmunol° gically defined ceⅡ popu- lations by Ⅱow cytometry;Approved GuideⅡn←second Edition(H42-A2)。Chnkal and Laboratory Standards Institute。2007,27(16):18-23 E21] Badley A,Baxter Ro⒍nson J,Bergeron M,et al。Canadan g“delines for flow cytometrk hnmunophenotyping-2001Edition。National Laboratory fQr HI`厂 I∏11nunology