血红蛋白测定参考方法
ICs 11.020
C50
中华人民共和国卫生行业标准
Ws/T341-ˉ 2011
血红蛋白测定参考方法
Reference Ⅱnethod for haemoglobinometry in human blood
2011-09-3o发布
一
中华人民共和国卫生部 发布
2012-04-015安方毡
Ws/T341-ˉ 2011
目刂
舀
本标准按照GB/T1.1-⒛09给出的规则起草。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准主要起草单位:卫生部临床检验中心。
本标准主要起草人:彭明婷、谷小林、李臣宾、施丽飞、陆红、申子瑜。
Ws/T341-ˉ 2011
血红蛋白测定参考方法
1 范围
本标准规定了血红蛋白测定参考方法的技术要求。
本标准适用于建立并运行血红蛋白测定参考方法的实验室。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
血红蛋白 hemog1oun,HGB/Hb
存在于血液中所有的血红蛋白衍生物,包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红
蛋白和高铁血红蛋白。
2.2
仅化商铁血红蛋白 haemigⅡobincyanide,HiCN
血红蛋白(除硫化血红蛋白外)中的亚铁离子被氧化成高铁离子,再与氰离子结合形成的血红蛋白
衍生物,即氰化高铁血红蛋白。
2.3
参考方法 reference method
一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术,该技术要有依据,可提供足够准确和精密的实验数
据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法,参考方法的准确性必须与决定性方法进
行比较,并且应标示不准确度和不精密度。
3 总则
为了保证参考方法检测结果的准确性,建立参考方法的实验室应与其他参考实验室进行结果比对。
4 原理
血红蛋白分子中的亚铁离子(Fe2+)在溶液中被高铁氰化钾氧化成高铁离子(Fe3+)形成高铁血红
蛋白(Hi),其后又与氰离子(CNˉ )反应生成氰化高铁血红蛋白(HCN),HCN在波长540nm处有最
大吸收峰,HCN吸光度严格遵循朗伯-比尔定律,即HCN在波长540nm的吸光度值与HCN浓度成
正比,血红蛋白浓度可由分光光度计所测定的吸光度值计算得出。
5 -般技术要求
5.1 设备
5.1.1 玻璃器具
试验所用的玻璃器具应为A级。
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规格要求:正向置换式微量加样器或吸量管100uL± 0.5uL、0.5mL± 0.005mL,容量瓶25mL±
o,03mL、100mL± 0.08mL、250mL± 0.12mL、1000mL± 0.3mL。
5.1.2 薄膜过滤器:由低蛋白结合和低释放材料制成,过滤器半径为25mm,薄膜孔径为0,⒛um~
o,25um。
5.1.3 分光光度计:所用的分光光度计应经计量部门检定合格,仪器的狭缝宽度≤2nm,配对比色杯
的内径为1.000cm±
0。002cm。
5.2 试剂(文-齐氏液,van KampeⅡ and z刂Istra reagent)
5.2.1 文-齐氏液的组成
KCN O。o5og
K3Fe(CN)6 0.20og
KH2P04(无水) 0.140g
非离子表面活性剂 0.5mL~1.0mL
临床实验室试剂用水,I级 1000。O mL
临床实验室I级试剂用水应满足以下指标:细菌数(10αV/mL;25℃条件下电阻抗)10mΩ ·cm;
硅含量(Sio2)(0.05mg/L。
所用化学试剂应为不含结晶水的分析纯。
非离子表面活性剂可使用Nonidet R40或THton Ⅺ1oo。
试剂中的氰化钾为剧毒物质,应规定相应的生物安全防护和处理要求。
5.2.2 试剂为清亮的淡黄色溶液,不吸收波长大于480nm的光。pH为7.0~7.4,渗透压为
6mOsm/(kg· H20)~7mOsm/(kg·
H2O)。
试剂应可使血红蛋白在5min内完全转化成氰化高铁
血红蛋白。
5.2.3 试剂应保存于较大且密封的棕色硼硅酸盐玻璃瓶内,室温避光保存,不能冷冻。如有浑浊物生
成,应重新配制。至少每月重新配制一次。
5.3 血标本的采集
5.3.1 用真空采血系统采集新鲜静脉血。采血时要避免皮肤消毒物质的污染。标本中不得有肉眼可
见的小凝块或溶血。
5.3.2 采集标本时使用EDTA为抗凝剂,要求加人血液后抗凝剂的终浓度为3.7umol/mL~5.4umol/
mL,可以使用以下几种抗凝剂:
——EDTA· K2(相对分子质量368.4),浓度为1.4m酽mL~2。Om酽mL;
——EDTA· K2· 2H20(相对分子质量404.5),浓度为1.5mg/mL~2.2mg/mL;
——EDTA· K3· 2H20(相对分子质量442.5),浓度为1.6m酽mL~2.4mg/mL;
——EDTA· N助·2H20(相对分子质量372.23),浓度为1.4mg/mL~2.0m酽mL。
5.3.3 血液加人抗凝管后,管内剩余空间至少占试管体积的⒛%,以利于血标本的混匀。
5.3.4 标本采集后应在当天完成测定。
6 测定步骤
6.1 标本稀释
6.1.1 取文-齐氏液加至容量为25mL的A级容量瓶中,将试剂液面调至刻度线。
6.1.2 用正向置换移液器吸取100uL混匀全血,使用蘸有盐水的纱布小心快速地擦掉毛细管外壁残
2
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留的血液(该过程应避免因虹吸作用带走毛细管内的血液),将毛细管中的血液加至装有试剂的容量瓶
中,吹吸至少5次,以保证血液全部从毛细管中洗出。同一份标本分次稀释后,检测结果的变异系数应
<0.5%。
6.1.3 盖上容量瓶盖子,充分颠倒混匀,直至红细胞完全溶解。
6.1.4 避光放置5min以上,以保证血红蛋白完全转化成氰化高铁血红蛋白。
6.1.5 用滤器过滤稀释后的标本。
6.1.5.1 使用注射器和特定的滤器(5.1.2)过滤。
6.1.5.2 滤液至少放置1min,以使气泡溢出。
6.2 血红蛋白浓度检测
6.2.1 使用分光光度计测定HCN溶液的吸光度值。
6.2.2 以试剂作空白,分别在504nm、540nm和750nm波长条件下,读取HCN溶液的吸光度值。
6.2.3 HCN溶液纯度与浊度的要求
纯度检查1.59≤
镳
≤1.63
浊度检查A鸵N≤0.003
6.3 血红蛋白浓度计箅
6.3.1 血红蛋白浓度计算公式见式(1):
c=
式中:
c
——血红蛋白浓度,单位为克每升(g/L);
A髁N
——HCN溶液在540nm时的吸光度
;
16114.5—— 血红蛋白单体的相对分子质量(4个单体组成的血红蛋白的相对分子质量为64娟8);
F
——血液的稀释倍数
;
11.0 ——HCN溶液在540nm时的1/4毫摩尔消光系数
;
d
—— 光径,为1.000cm;
1000 ——将毫克转换为克的倍数。
6.3.2 当稀释倍数为1g251,光径为
1。000cm时,式(1)可表达为
c=A髁N× 367.7 ⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨⋯(2)
7 血红蛋白结果的表达方式
血红蛋白浓度以g/L形式表示。
Ⅵ`s/T341ˉ
ˉ2011
佥
考
文
献
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